作者：张艳芬，许重洁，杨保胜

作者单位：新乡医学院生命科学技术系，河南 新乡 453003;新乡医学院基础医学院，河南 新乡 453003

《新乡医学院学报》2008年5月25卷3期 基础研究

 

【摘要】  目的 探讨微核检测的最佳方法。方法 20只小鼠随机分为实验组和阴性对照组，每组10只。实验组小鼠腹腔注射环磷酰胺60 mg·kg-1，阴性对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL，2组均为每日1次，连续注射3 d。取小鼠的外周血、骨髓液和睾丸组织细胞，分别采用外周血微核检测方法、骨髓微核检测方法及睾丸微核检测方法观察微核结果。结果 外周血微核检测方法未观察到微核；骨髓微核检测法微核很易观察到，细胞中出现1个、2个或3个微核的结果都清晰可见；睾丸微核检测方法观察到出现微核的细胞较少。骨髓微核检测法，实验组和阴性对照组的微核发生率分别为（7.5±1.34）‰和（2.9±0.38）‰，2组间有极显著差异（P＜0.01）；睾丸微核检测法实验组和阴性对照组的微核发生率分别为（5.5±0.84）‰和（1.5±0.41）‰，2组间有显著差异（P＜0.05），且实验组微核发生率骨髓微核检测方法高于睾丸微核检测方法（P＜0.05）。结论 3种方法中骨髓细胞微核检测方法最佳。

【关键词】  微核；检测方法；小鼠

基金项目：河南省教育科学“十一五”规划课题（编号：2007－JKGHAG-342）

　　Comparision of three methods of micronucleus detection

　　ZHANG Yan-fen,XU Chong-jie,YANG Bao-sheng

　　1.Department of Life Science and Technology,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;

　　2.College of Basic Medicine,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China

    Abstract:  Objective  To investigate the best method of micronucleus detection.Methods  Twenty mice were divided randomly into experiment group and negative control group,10 in each group.The experiment group were given peritoneal inject of cyclophosphamide（60 mg·kg-1）.The negative control group were given peritoneal injection of 0.5mL sodium chloride.Both groups were injected once a day and continuously 3 days.Peripheral blood,bone marrow cells and testicle cells were obtained.Then the states of micronucleus of them were detected by the detective method of peripheral blood,marrow and testis respectively.Results  No micronucleus was found in peritoneal blood.Micronucleus were easy to be found in bone marrow micronucleus.The findings with one,two or three micronuclei in cells were all observed clearly.In testicle micronucleus detection,micronucleus was not easy to be found.The micronucleus incidence rates of the experiment group and the negative group were （7.5±1.34）‰ and（2.9±0.38）‰,respectively.There were significent differencesbetween the two groups（P＜0.01）.The micronucleus incidence rates of the experiment group and the negative group were（5.5±0.84）‰ and（1.5±0.41）‰ respectively.There were significent differencesbetween the two groups（P＜0.05）.In the experiment groups,micronucleus incidence detected in bone marrow was higher that in testicle（P＜0.05）.Conclusion  The method of micronucleus detection in bone marrow cells is the best.

    Key words:  micronucleus;detection method;rat
   
    微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，染色同主核，其直径一般为主核的1/3～1/2,主要由外界损害因素（生物、物理、化学）作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。因此，微核实验在对外来化合物（如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染等）遗传毒性和职业暴露人群遗传损害检测以及生态环境检测方面都有大量的应用，是遗传毒理实验的一种常用的细胞遗传学方法，作者比较了3种常用的微核检测方法，旨在找出一种简单、特异性强、实验结果稳定的方法，为教学或科研工作提供参考。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物 

　　昆明种雄性小白鼠20只，8～10周龄、体质量18～22 g，由新乡医学院实验动物室提供。实验前饲养3 d。

　　1.2  主要试剂 

　　环磷酰胺（cyclophosphamide,CP），由上海华联制药有限公司生产。

　　1.3  实验方法 

　　将20只小鼠随机分为实验组和阴性对照组各10只。实验组小鼠腹腔注射环磷酰胺60 mg·kg-1；阴性对照组向小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL；2组均为每日1次，连续注射3 d。将处理好的小鼠颈椎脱臼法处死，分别按以下方法取材：（1）外周血微核检测方法：参照陈细香［1］的方法，取心脏血,制备血涂片。涂片晾干后,甲醇固定10 min,用体积分数10％的Giemsa染液染色15 min，细水流冲洗晾干，即可观察。（2）骨髓微核检测方法：按贾庆军等［2］的方法，稍加改造，取双侧的小鼠股骨，剪去骨的两端，用小牛血清冲洗骨髓，直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液1 500 r·min-1离心8 min(上海安亭科学仪器厂生产的飞鸽牌离心机)，弃上清，然后用约0.5 mL的小牛血清将沉淀悬浮起来。每个载玻片滴1滴，涂开后于空气中自然干燥，甲醇固定15 min，晾干后用体积分数10％的Giemsa液染色15 min，细水流冲洗晾干，即可观察。（3）睾丸微核检测方法：按文献［3］的方法，取小鼠一侧睾丸，置于洁净载玻片一端，剥除睾丸被膜，用眼科剪将曲细精管剪碎，其上滴2～3滴0.22×10-4 g·L-1的柠檬酸三钠，在载片上与曲细精管充分混合，将玻片一端略微抬高，使细胞悬液与曲细精管分离，取适量细胞悬液推片，自然干燥，甲醇固定15 min，晾干，用体积分数20％Giemsa染液染色15 min，细水流冲洗晾干，显微镜下观察。实验组和阴性对照组各统计2 000个细胞。

　　1.4  统计方法 

　　结果以均数±标准差(x±s)表示，数据用SPSS 11.0软件进行方差分析。

　　2  结果

　　2.1  3种微核检测方法的微核细胞学特征 

　　小鼠外周血中没有观察到微核；在小鼠骨髓细胞微核涂片上，收集到的细胞密度适中，微核较易观察到，不但观察到有1个微核，而且细胞中出现2个或3个微核的结果也清晰可见，见图1。小鼠睾丸细胞涂片上，细胞密度高，观察到出现微核的细胞较少，并且也未观察到出现2个或2个以上微核的细胞存在，见图2。

　　2.2  3种微核检测方法的微核发生率比较 

　　小鼠外周血细胞微核检测中，微核发生率为0；在骨髓微核检测方法中，实验组的微核发生率为（7.5±1.34）‰，阴性对照组的微核发生率为（2.9±0.38）‰，2组间有极显著差异（P＜0.01）；在睾丸微核检测方法中，实验组的微核发生率为（5.5±0.84）‰，阴性对照组的微核发生率为（1.5±0.41）‰，2组间有显著差异（P＜0.05），且实验组微核发生率骨髓微核检测方法高于睾丸微核检测方法（P＜0.05）。

　　3  讨论

    因为小鼠成熟的红细胞没有细胞核，在血细胞中，只有白细胞有核，而白细胞的含量在外周血中仅占约1％，所以，用外周血微核检测方法涂片后，效果很差。并且，作者反复多次、多人实验后，做了30余张片子，都很难观察到被染料着色的细胞。虽然也有相关方面的实验报道［4］，但它对初学者来说有一定难度。大多数人都是将外周血进行2～3 d的培养后，再进行检测，但涉及到细胞培养，实验就会变得复杂，首先要清洗、高温灭菌培养中所用到的器具，培养中所用到的试剂也要灭菌消毒，还涉及到严格的无菌操作技术，这样使实验的难度、耗时及成本都会成倍的增加。换个角度，可以将实验材料换成蛙（或蟾蜍）或鸡，因为它们的外周血红细胞是有核的，可以直接观察外周血红细胞的微核率，这方面的实验已有报道［5-7］，但还需做进一步的预实验确认。因此，小鼠外周血细胞微核发生率为0，并不表示环磷酰胺对小鼠外周血细胞微核发生没有影响，更多的是方法上的原因，因为收集到的外周血中有核细胞太少，致使不易观察到。

    对于小鼠骨髓细胞的微核检测，作者做了适当的改进，改用冲洗收集骨髓细胞的方法，这样既避免了小鼠胸骨小，操作不便的缺点，又可以取得大量的骨髓细胞，既操作方便又可以满足多数人同时实验对材料的大量需要。而且，用Giemsa染色，取得了令人满意的效果。这样，只用普通的光学显微镜就能观察，在普通实验室就可开展。在睾丸微核检测中，出现微核的细胞较少，且发现很多细胞在主核附近有类似于微核的小核存在，但其染色并不与主核相同，因此，不能确切判断。所以，在这种方法中，Giemsa染色特异性差些，微核的确定会受到很大干扰，不易辨别，实验效果远不如骨髓细胞微核。为了实验的严谨性，作者在实验中设立了阴性对照，而在阴性对照中，都很难观察到微核，说明实验组中普遍出现的微核现象是环磷酰胺作用的结果。

    3种方法中，骨髓微核检测法微核很易观察到，实验组和阴性对照组间有极显著差异，且方法方便、稳定，Giemsa染色后效果好，清晰且易辨认；睾丸微核检测法观察到出现微核的细胞较少，实验组和阴性对照组的微核发生率只有显著差异，且Giemsa染色特异性差些，微核的确定会受到干扰，不易辨别；实验组微核发生率骨髓微核检测方法高于睾丸微核检测方法；外周血细胞微核检测方法未观察到微核。总之，在这3种方法中骨髓微核检测方法为最佳。

【参考文献】
  　　［1］陈细香，卢昌义，黄荣昌．5种洗发剂对泥鳅红细胞微核的影响［J］．淡水渔业，2007，37（5）：19-22．

　　［2］贾庆军，郭魁亮，刘天鹏，等．环磷酰胺对小鼠遗传和生殖毒性影响的研究（1）——对骨髓细胞微核和染色体的影响［J］．白求恩军医学院学报，2006，4（1）：6-7．

　　［3］贾庆军，郭魁亮，刘天鹏，等．环磷酰胺对小鼠遗传和生殖毒性影响的研究（2）——对雄性小鼠生殖细胞的影响［J］．白求恩军医学院学报，2006，4（2）：70-71．

　　［4］李尊爱，杨树媛，王 静，等．小鼠外周血网织红细胞微核吖啶橙染色法的研究［J］．卫生毒理学杂志，1999，13（2）：144-146．

　　［5］宋培勇．不同环境中雏鸡外周血液红细胞微核率变化的研究［J］．遵义师范学院学报，2006，8（1）：65-66．

　　［6］苑宇哲，徐士霞，姚春生，等．阿特拉津对弹琴蛙（Ranaadenopleura）蝌蚪微核和核异常的影响［J］．应用与环境生物学报，2005，11（3）：333-336．

　　［7］潘晓赋，周 伟，蔡佩玲．昆明地区4种蛙血红细胞微核与环境质量关系［J］．农业环境科学学报，2003，22（4）：437-441．