【摘要】 目的 观察阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV）单药治疗慢性乙型肝炎（慢乙肝）过程中发生病毒突破的患者乙型肝炎病毒（HBV）P基因区变异发生情况。 方法 选取51例阿德福韦酯单药治疗（10?mg/d，疗程＞12月）发生病毒突破的慢乙肝患者作为研究对象，分别检测随访发现病毒突破时患者的血清ALT、HBV DNA水平，并采用PCR产物直接测序法分析HBV P区基因的变异发生情况。结果 51例患者中有37例检测出阿德福韦酯耐药相关变异，且rt181位点变异多于rt236位点（分别为33例和8例，其中两位点联合变异4例，P＜0.001）。联合变异患者其血清HBV DNA水平高于单一变异患者［分别为（6.53±0.45）log10拷贝/mL、（5.37±1.08）log10拷贝/mL，P＝0.043］。结论 在应用阿德福韦酯单药治疗的慢乙肝患者中可筛选出HBV P基因区的相关耐药变异，不同耐药位点患者的HBV DNA水平可有差异。
【关键词】 肝炎，乙型，慢性；肝炎病毒，乙型；变异；阿德福韦酯；耐药
The P gene of hepatitis B virus in chronic hepatitis B patients who hadviral breakthrough during longterm adefovir dipivoxil monotherapy
LIU Feng, WANG Lei, WANG Lina, GENG Daying
Jinan Infectious Disease Hospital, School of Medicine, Shandong Universtiy, Jinan 250021, China
To investigate the mutations in the P gene of hepatitis B virus (HBV) in chronic hepatitis B(CHB) patients who had viral breakthrough during longterm adefovir dipivoxil monotherapy. Methods 51 CHB patients who had viral breakthrough during longterm adefovir dipivoxil(ADV) monotherapy(10?mg/d, duration >12 months) were enrolled in this study. Sera were collected when viral breakthrough was confirmed, and ALT, HBV DNA(real time quantitative PCR), and sequences of partial HBV P gene were determined. Results Mutations related to ADV resistance were found in 37 of 51 CHB patients. The frequency of mutation at rt181 was significantly higher than that at rt236 (33 vs 8, P<0.001). Serum HBV DNA load in patients with combination mutations were higher than that with a single mutation when the viral breakthrough occurred (6.53±0.45log10 copies/ml vs 5.37±1.08log10 copies/ml, P=0.043). Conclusions Mutations in HBV P gene can develop during ADV monotherapy in CHB patients. The HBV levels may differ in patients with different mutations.
Key words： Hepatitis B, chronic; Hepatitis virus B; Mutation; Adefovir dipivoxil; Drug resistance
阿德福韦酯是被国家食品药品监督管理局（SFDA）批准用于抗乙型肝炎病毒（HBV）的第二个核苷（酸）类似物。基础及临床研究表明，阿德福韦酯对HBV野毒株和拉米夫定耐药相关的YMDD变异株均有明显的抑制作用；但长期应用阿德福韦酯的慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者，其HBV也会发生阿德福韦酯相关的耐药变异。本研究对阿德福韦酯治疗过程中发生病毒突破的慢乙肝患者进行了耐药相关研究。
1 资料与方法
1.1 病例来源
济南市传染病医院2004年9月～2006年5月门诊及住院的51例慢乙肝患者，慢乙肝诊断符合2000年全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的诊断标准［1］。所有入选病例单用阿德福韦酯治疗（10?mg/d，疗程＞12月），男性43例，女性8例，年龄18～66岁。其中44例为拉米夫定耐药患者，耐药后与阿德福韦酯重叠1～3个月后单用阿德福韦酯治疗；7例为阿德福韦酯初治病例。所有患者在治疗过程中均发生病毒突破。病毒突破定义为应用阿德福韦酯后血清HBV DNA下降＞2 log10拷贝/mL，继续治疗过程中HBV DNA较最低点上升幅度＞1 log10拷贝/mL。
1.2 主要试剂及仪器
核酸提取试剂盒及HBV DNA荧光定量试剂盒购自深圳匹基生物技术有限公司；DNA回收试剂盒购自美国OMEGA公司；实时定量PCR采用Roche Light Cycler（德国）荧光定量核酸分析仪。
1.3 PCR扩增和产物直接测序
搜索GenBank上的HBV全基因序列，根据HBV DNA P基因保守序列，应用软件Primer Premier5和Oligo6设计引物PS1及PSA1，使PCR产物涵盖逆转录酶区rt 100～250编码区域(nt 427～877)。PS1序列为： 5′ GCTATCGCTGGATGTGTCTG 3′（nt 366～385），PSA1序列为：5′ GTACAATATGTTCCTGCGGTA 3′（nt 928～908）。
PCR扩增采用50μL反应体系：10×buffer 5?μL，dNTP 1?μL，DNA模板10?μL，上下游引物各0.5?μL，Taq酶（25?μM）0.5?μL，灭菌水至50?μL。反应条件： 94?℃ 3?min 预热，94?℃ 30?s，53?℃ 50?s，72?℃ 30?s，共35个循环， 最后72?℃再延伸7?min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后采用E.Z.N.A Gel Extraction Kit，按说明书进行DNA纯化回收，纯化回收的PCR产物送上海博亚公司测序。
1.4 HBV基因型、P区基因的序列及编码氨基酸的分析方法
以GenBank的基因分型中23株基因型为A～H型的HBV全基因组标准序列为参照序列，经clustalW 程序计算得出基因型。利用DNASTAR7.1软件对37例血清HBV DNA序列与标准株进行比较。HBV各编码区氨基酸变异的分析采用Vector NTI9.0进行。
1.5 统计学处理
所有统计学处理采用 SPSS 10.0统计学软件进行。符合正态分布的计量资料的比较采用t检验，否则采用非参数检验；计数资料的比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 病毒突破时ALT及HBV DNA水平
51例患者在随访发现病毒突破时血清ALT为22～526?IU/L，中位数67?IU/L，血清HBV DNA水平为(5.60±1.12)log10拷贝/mL。
2.2 PCR扩增和HBV P区基因序列的分析
2.2.1 PCR扩增结果
目标产物为HBV P基因片段,长度572?bp。经1％琼脂糖电泳鉴定，51例患者血清HBV DNA均成功扩增出目的片段。PCR产物电泳图见图1。
2.2.2 HBV基因型分析
采用clustalW 程序将所测序列与GenBank基因分型中23株基因型为A～H型的HBV全基因组标准序列进行比较，根据所得进化树图进行判断，本研究51例患者血清HBV均为C基因型。
2.2.3 阿德福韦酯耐药相关变异及各变异组比较
阿德福韦酯耐药相关变异见图2。由图2可见，阿德福韦耐药相关典型变异如下：①nt670位点由鸟嘌呤（G）突变为腺嘌呤（A），使编码的rt181位点的氨基酸由丙氨酸（A）变为苏氨酸（T）；②nt671位点由胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），使编码的rt181位点的氨基酸由丙氨酸（A）变为缬氨酸（V）；③nt836位点由腺嘌呤（A）突变为胞嘧啶（C），使编码的rt236位点的氨基酸由门冬酰胺（N）变为苏氨酸（T）。 51例患者中，单一rt181变异29例，其中20例为rtA181V，9例为rtA181T。29例中有6例血清病毒为变异株与野毒株同时存在的混合株。单一rt236变异4例，均为rtN236T。rt181和rt236联合变异4例，均为rtA181V＋rtN236T。其中2例为混合株。 各位点变异情况总结见表1。由表1可见，本组患者rt181变异明显多于rt236变异（分别为33例和8例， P＜0.001）。将患者分为rt181变异组(n=29)、rt236变异组(n=4)及联合变异组，比较三组发生病毒突破时ALT、HBV DNA水平，其差异均无统计学意义（P＞0.05，见表2）。表1 51例患者rt181和rt236变异情况（略）表2 各变异组ALT及HBV DNA比较（略）
将37例HBV P基因变异阳性的患者分为单一变异组（n=33）和联合变异组(n=4)，联合变异组HBV DNA明显高于单一变异的另两组(P=0.043)。如表3。表3 单一变异组/联合变异组比较表（略）
3 讨 论
阿德福韦酯是5′单磷酸脱氧阿糖腺苷的无环类似物，在体内水解为阿德福韦发挥抗病毒作用。多项随机双盲安慰剂对照的临床试验表明，在慢乙肝患者，口服阿德福韦酯可明显抑制HBV DNA的复制。 对HBeAg阳性患者，应用1、2、3年时的HBV DNA转阴率 (<1000拷贝/mL) 分别为28%、45%和56%，HBeAg血清学转换率分别为12%、29%和43%［2］；对HBeAg阴性患者，应用1、2、3年HBV DNA转阴率 (<1000 拷贝/mL) 分别为51％，71％，79％［3，4］。基础及临床试验表明，阿德福韦酯对拉米夫定、泛昔洛韦等耐药的HBV变异株亦有抑制作用［5，6］。
阿德福韦酯较少产生耐药性，其不易产生耐药的分子基础为:①与自然底物dATP在结构上非常相象；②具有灵活的开链连接；③具有磷酸键。临床观察显示，对HBeAg阳性患者，应用1、2、3年其耐药发生率分别为0%、1.6%和3.1%；对HBeAg阴性患者，应用1、2、3、4、5年的基因耐药发生率分别为0%，3%，11%，18%和29%［7］。对拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者，其耐药发生率明显高于初治患者［8］。
目前已证实阿德福韦酯耐药相关的变异主要包括rtA181V/T和rtN236T变异及两者的联合变异，还可以伴有L80V/I, V84M, V214A, Q215S, P237H, N238V/T等其他变异，后者为次要变异，可能为代偿变异。但多项研究证实，HBV逆转录酶区181和236位的变异与临床的耐药直接相关，故目前对ADV耐药的研究主要集中在rt181和rt236位的变异上［9，10］。体外药敏试验表明，单一rtA181V、 rtN236T 变异可使HBV对阿德福韦酯敏感性分别下降4.3倍和7倍，而rtA181V＋rtN236T联合变异可使药物敏感性下降18倍［9］。本研究在51例接受阿德福韦酯治疗过程中发生病毒突破的慢乙肝患者中检出37例患者血清HBV存在rtA181V/T和/或rtN236T变异，与文献报道的阿德福韦酯相关变异一致；耐药变异检出率较高（72.55％），可能与PCR产物直接测序的敏感性较高有关。本研究发现rt181位点变异明显多于rt236位点变异，其rtA181V/T变异多发是否与纳入病例均为C基因型有关（本研究基因型），还有待进一步研究证实。在发生耐药变异的患者中联合变异组HBV DNA水平较单一变异组高，这与文献报道的变异位点体外药敏试验结果一致，但联合变异组样本量较小，有待扩大样本进一步证实。
本研究发现有8例拉米夫定耐药患者在换用阿德福韦酯＞12月后仍存在拉米夫定耐药相关变异，证实YMDD变异株作为优势株可存在较长时间。
体内与体外研究发现， rtA181V/T对拉米夫定敏感性下降，而单一rt236T变异株对拉米夫定仍敏感。本研究中数例rtA181V/T变异患者加用拉米夫定后3个月后，HBVDNA水平下降不明显，而单一rt236T变异的4例患者加用拉米夫定后HBVDNA下降均>2log10，与文献报道一致。对于存在rtA181V/T变异的患者，根据文献报道的体外试验结果，此变异株仍然对恩替卡韦（Entecavir）和泰诺福韦（Tenofovir）敏感［11］，建议应用恩替卡韦或泰诺福韦治疗。Thibault 等应用泰诺福韦治疗1例阿德福韦酯耐药患者，取得了良好的病毒学应答［12］。
总之，本研究以较大样本证实了长期单用阿德福韦酯治疗的慢乙肝患者可发生rtA181V/T与rtN236T变异，且发现rt181变异较rt236变异多发。建议在临床工作中，对阿德福韦耐药患者应明确其耐药变异发生位点，以此为依据选择抗病毒药物。
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