金雀异黄素体外对猪脑微管蛋白聚合的影响 - 医学资源网健康保健医学课件内科外科妇科儿科针灸推拿骨伤科医学试题医学论文医案民间单方

【摘要】目的 研究金雀异黄素（Gen）对微管蛋白聚合的影响。方法在离体条件下，将受试化合物加入到微管蛋白聚合-解聚反应体系中，于37℃、350nm下检测反应体系吸光值的变化。结果 Gen能抑制反应体系吸光值升高，提示它对微管蛋白聚合具有抑制作用。结论 Gen能抑制体外微管蛋白聚合，从而可能是影响细胞的细胞周期及诱导凋亡途径之一。

    【关键词】 金雀异黄素微管蛋白聚合

    Effect of genistein on tubulin polymerization in vitro

    Liu Yi，Wu Yulian，Liang Nianci.

    Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Nature Drugs，Zhanjiang   524023.

    【Abstract】 Objective To study the effect of genistein on tubulin polymerization.Methods Genistein was added into the tubulin polymerization-depolymerization system and the changes of absorption values at 350 nm，37 ℃ was recorded.Results Genistein decreased the absorption values of the reaction system，and markedly inhibited tubulin polymerization.Conclusion Genistein inhibits tubulin polymerization， and leads to cell cycle arrested， and possibly induces apoptosis.

    【Key words】 genistein tubulin polymerization

    植物雌激素金雀异黄素（genistein，Gen）能抑制HL-60、MOLT-4、HGC-27等不同肿瘤细胞在体外的生长，可作为一种潜在的肿瘤化学预防剂，但其作用机制非常复杂。最近的研究发现Gen也可抑制HB-EGF、SGC-7901等细胞生长［1］，将细胞周期阻滞在G1和G2期，并可特异性地抑制细胞内酷氨酸激酶活性［2］和拓扑异构酶Ⅱ［3］，能引起Cyclin D1表达下降和细胞骨架排布方式的改变。本文旨在通过研究Gen体外对猪脑微管蛋白聚合的影响试图从细胞骨架和有丝分裂着手寻找其诱导肿瘤细胞凋亡的新途径。目前国内尚无Gen影响微管蛋白聚合方面的研究报道。

    微管（microtubule）是由α、β-微管蛋白（tubulin）异源二聚体及少量微管结合蛋白聚合而成的亚稳定的动态结构。在正常细胞内，微管蛋白形成微管的过程是一个动态平衡的过程。微管存在于所有真核细胞中，构成细胞的骨架，维持细胞形态和锚定细胞器的位置，参与细胞收缩、伪足运动及细胞内物质运输。细胞质中的微管在细胞分裂前期解聚组成纺锤体，纺锤体在细胞的有丝分裂过程中对染色体的移动及子核的分裂起着非常重要的作用。

    1 材料与方法

    1.1 受试化合物 Gen，DMSO助溶，使用前按1︰1200稀释；秋水仙素、紫杉醇购自sigma公司。

    1.2 试剂 MES、GTP、EGTA购自sigma公司；丙三醇、MgCl2为国产分析纯。

    1.3 微管蛋白的分离纯化参照文献［4，5］提取微管蛋白的方法略有改进。

    把刚屠宰的成年猪脑，置于冰上去除脑膜、大血管并剪碎，用预冷的MES缓冲液（MES 0.1mol/L，EGTA 0.1mmol/L，ATP 1.0mmol/L，MgCl2 0.1mol/L，用HCl调pH值至6.5）清洗2次，捣碎后制成匀浆。

    将脑组织匀浆在4 ℃、105，000×g条件下离心1h，取上清液，加入等体积的MES聚合缓冲液（MES 0.1mol/L，EGTA 1.0mmol/L，ATP 1.0mmol/L，MgCl2 0.5 mol/L，丙三醇80mol/L，用HCl调pH值至6.5），置于37 ℃水浴中保温30min，期间微微摇动数次，再在26 ℃、105，000×g条件下离心1 h，弃上清，用约1/10匀浆体积的预冷MES缓冲液将沉淀物分散，置于冰水浴中30 min，使沉淀物基本溶解。再将溶液按上述高、低温离心步骤重复进行1次，将离心后获得的沉淀物，用少量预冷的MES缓冲液在冰水浴中溶解，得到微管蛋白溶液。

    1.4 微管蛋白含量的测定按Lowry’s法测定微管蛋白含量。

    1.5 微管蛋白的鉴定用浓度为12%的分离胶（pH8.8），7.5%的浓缩胶（pH6.7）进行SDS-PAGE电泳，0.05%考马斯亮蓝R250染色。

    1.6 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应在冰浴的比色杯中加入已纯化的微管蛋白，然后加入GTP（母液5μl），使其终浓度为100mmol/L。在4 ℃于350nm处迅速调零，放入37 ℃水浴中恒温，每间隔3min取出测其A350值，根据所测得的吸光值的变化绘制微管蛋白聚合曲线。当聚合曲线逐渐上升进入高坪期，说明微管蛋白聚合-解聚反应趋于平衡，待聚合反应基本结束后（该段聚合-解聚平衡时期大约持续20min），将比色杯放入冰水浴中冰浴20min，这段时间内每间隔3min测定A350值，解聚曲线逐渐下降进入低坪期后，解聚反应基本结束。

    1.7 5F对微管蛋白聚合-解聚活性的影响在上述微管蛋白聚合-解聚的反应系统中实验组加入不同浓度Gen药液（5μl），使其终浓度分别为40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L；阳性对照组分别加入秋水仙素、紫杉醇，使其终浓度分别为4μmol/L和2μmol/L；空白对照加入无菌三蒸水代替上述受试化合物，按上述测量方法记录A350的连续变化。

    1.8 结果评价抑制率（%）=（1－实验组A350/对照组A350）×100%。

    2 结果

    2.1 微管蛋白含量的测定与鉴定 Lowry’s法测定微管蛋白含量为8 mg/ml。SDS-PAGE电泳结果见图1。

    1.40mg tubulin，2.80mg tubulin，3.160mg tubulin

     Fig1 Electrophoresis of tubulin purified from porcine brain on a SDS polyacrylamide gel

    2.2 微管蛋白聚合-解聚反应平衡体系动态变化见图2。

    Fig2 Disperse graph of tubulin polymerization at 37℃ (0～20min) and tubulin depolymerization at 4℃ (40～60min)

    图2表现了微管蛋白聚合-解聚反应平衡体系的动态变化：在37℃条件下聚合（0～20min）；在4℃条件下解聚（40～60min），该图平台期反应了在聚合条件下聚合-解聚之间的动态平衡。

    2.3 秋水仙素、紫杉醇对微管蛋白聚合-解聚反应的影响参照文献［6，7］提供的秋水仙素和紫杉醇对微管蛋白聚合-解聚反应的影响浓度，在本实验中它们的终浓度分别采用4μmol/L和2μmol/L，其结果如图3所示。

               Fig3 The effects of colchicine、taxol on tubulin

    图3平台期反映了在聚合条件下聚合-解聚之间的动态平衡。秋水仙素对微管蛋白聚合存在明显的抑制效应，在37℃恒温过程中抑制微管蛋白聚合（0～40 min）。这与秋水仙素能结合于微管蛋白端部从而抑制微管蛋白聚合作用的机制相一致；紫杉醇在37℃恒温条件促进微管蛋白聚合（0～40min），在4℃下抑制其解聚（40～60min），这与其能促使微管蛋白迅速聚集成微管并结合到微管上抑制微管的解聚的机制相符合。

    2.4 Gen对微管蛋白聚合-解聚反缨的影响见图4。从图4可看出，Gen能抑制微管蛋白的聚合，且与浓度相关。终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的Gen使微管蛋白的最大吸光值分别变为0.136、0.109、0.095、0.058。抑制率分别为13.4%、30.6%、39.5%、63.1%。

               Fig4 The effects of diverse doses of Gen on tubulin

    3 讨论

    微管和微管蛋白的相互作用是靶向性筛选抗肿瘤化合物的重要模型之一。实验证明，大量的天然和合成化合物能干扰微管蛋白的功能。它们主要是抑制微管蛋白聚合，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止在有丝分裂中期，或是促进微管聚合，抑制微管解聚而抑制细胞分裂。

    在细胞的有丝分裂过程中，细胞临近分裂前期时细胞质中微管解聚成微管蛋白亚基，细胞进入有丝分裂早中期后，纺锤体侵入细胞中心区，纺锤体微管蛋白捕捉动粒。当染色体排列在赤道上后，细胞进入有丝分裂中期，纺锤体微管通过微管蛋白的聚合与解聚牵引染色体向两极运动，到分裂后期纺锤体微管解聚为微管蛋白，因此，作用于细胞有丝分裂期的各个有关于微管的时相就可能使有丝分裂受阻而导致细胞凋亡。

    本研究发现，Gen在离体条件下对猪脑微管蛋白聚合-解聚体系存在着影响。它能抑制微管蛋白的聚合，使微管蛋白在聚合条件下不能正常聚合正为微管，阻断微管在细胞有丝分裂中的作用。这种抑制作用与秋水仙素对微管蛋白的作用结果相似。Gen这种在体外对微管蛋白聚合的影响可能是其引起肿瘤细胞凋亡途径之一。

                 【参考文献】

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