关键词: 乙型肝炎病毒；核酶；基因治疗

　　【摘要】　目的　体外研究核酶对乙型肝炎病毒(HBV)前S2基因的作用。方法　设计合成一针对HBVayw DNA前S2区第110，122和132位碱基的三靶位串联锤头状核酶基因，体外转录核酶基因和靶基因并进行切割实验；将核酶基因与逆转录病毒重组，转导2.2.15细胞，观察转导细胞聚人血清白蛋白受体(pHSA-R)的表达水平。结果　核酶在体外可有效切割靶基因转录物，在转入2.2.15细胞后4周内对pHSA-R表达抑制率为51.45±4.57%～41.01±4.16%。结论　本文设计合成的针对乙型肝炎病毒前S2基因的核酶在体外具有相应的生物学活性。

Synthesis and preliminary study on cleavage activity of ribozyme to hepatitis B virus preS2 gene in vitro　Xu Dongping,Han Fenglian,Shi Hong,et al.Biological Engineering Laboratory of 302 Hospital,Beijing 100039
　　Abstract　In this paper,a multi-target hammerhead ribozyme gene was synthesized directed against 110,122 and 132 sites of nucleotide of HBV preS2 gene.The target gene fragment was cut from HBV genome containing plasmid pCP10.Both of the ribozyme and the target gene fragments were cloned into pGEM3Zf(-)plasmid and sequenced by dideoxy chain termination method.The transcription of both gene fragments was performed in vitro utilizing T7 RNA promoter in pGEM3Zf(-)plasmid.The cleavage activity of ribozyme to substrate was confirmed in vitro. For further evaluating intracellular function of ribozyme,two ribozyme-retroviral recombinant plasmids with different promoter type pDOR-ripc and tRNA-ripc were constructed.Pseudo-virus was collected through routine packaging procedure and transduted into 2.2.15 cells.RIA data showed a stable inhibition of pHSA-R antigen expression to the lowest extent of 41.01%±4.16 and the highest extent of 51.45%±4.57 within 4 weeks after transduction.No influence,however,on HBsAg and HBeAg expression was demonstrated after ribozyme gene transfer.
　　Key words:　Hepatitis B virus　　Ribozyme　　Gene　therapy


　　核酶(Ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可以特异切割靶RNA序列。核酶的催化中心有相对固定的序列，而切割特异性则由催化中心两侧序列与何种靶分子序列互补而决定。根据核酶这一特性，可以人工设计针对某一病毒RNA的核酶分子，破坏病毒转录产物而对机体无害^［1］。将针对多个位点的核酶序列串联成一个多靶位核酶分子，可显著降低由于病毒变异逃逸核酶切割的机率^［2］。核酶分子可以通过常规的转基因手段转入细胞或机体，多种人工设计的核酶活性在体外和细胞水平得到证实^［3，4］。针对乙型肝炎病毒的核酶研究也表明核酶可在体外切割靶基因转录产物，在细胞内部分抑制靶基因表达^［5～8］，但在这些研究中，核酶的作用位点限于HBV S区、前C/C区基因和包装信号序列。鉴于HBV前S2基因(3?213～156)编码的含55个氨基酸的P31蛋白具有聚白蛋白受体活性，在病毒传播中起重要作用^［9］，我们设计了针对该基因第110，122和132位碱基的三靶位串联锤头状核酶，在体外对核酶的切割活性进行观察，并将核酶分子与不同启动子类型的逆转录病毒载体重组，转导能稳定分泌HBV各组抗原的2.2.15细胞，对核酶在细胞内抑制相应抗原的表达作用进行了初步研究。

1　材料和方法
1.1　质粒，菌株，细胞株　含有头尾相连HBV ayw双体的pCP10质粒和逆转录病毒质粒pDORNeo为302医院生物工程研究室保存，质粒pGEM3Zf(-)购自华美公司，逆转录病毒质粒N2A-tRNA由美国西奈山医科大学王福生博士惠赠，PA317细胞和NIH/3T3细胞由中国医学科学院肿瘤研究所吴易元教授惠赠，2.2.15细胞引自中国医学科学院生物技术研究所。
1.2　工具酶和其他主要试剂　工具酶购自美国Promega公司和华美公司，SP6和T7转录试剂盒购自德国宝灵曼公司，PCR产物纯化试剂盒购自美国Clontech公司，Lipofectamine、RPMI1?640、G418购自美国GIBICO公司，［α-³²P］UTP购自亚辉生物医学工程公司，检测pHSA-R、HBsAg和HBeAg抗原的固相放射免疫试剂盒为福瑞公司产品。
1.3　DNA片段合成和引物合成　分别由军事医学科学院和上海生物工程公司合成，DNA序列分析用ABI310基因分析仪。
1.4　核酶基因和靶基因片段获取　核酶基因分63nt和60nt两个片段合成，片段间部分互补，通过Klenow酶填补连接成105bp的全片段，再经过与一对设计引物进行PCR扩增，在核酶片段的5′和3′端分别引入BamH I和Sal I位点。HBV靶基因片段通过EcoR I+BamH I酶切pCP10质粒后用电泳胶回收488bp片段获得。将两种基因片段分别克隆到pGEM-3Zf(-)质粒中进行序列分析。
1.5　核酶体外转录及对HBV靶基因转录物的切割　用HindⅢ对核酶和HBV靶基因重组质粒进行线性化切割，利用pGEM-3Zf(-)质粒的T7启动子进行体外RNA转录，同时分别用HindⅢ和PvuⅡ切割pGEM-3Zf(-)空载质粒作为转录试验的分子量参照，利用载体上的SP6启动子进行转录。反应条件参照德国宝灵曼公司试剂盒说明，掺入同位素为［α- ³²　P］UTP，转录完成后用无RNase的DNase消化模板DNA，并用酚抽提转录产物，乙醇沉淀RNA。将转录的核酶RNA(未标记同位素)和HBV靶序列RNA以适当比例混合进行切割反应，在20mmol/LMg⁺⁺，50mmol/LTris-C1,pH8.0的缓冲体系中37℃切割1小时。转录和切割产物用含7M尿素的5%PAGE电泳分离，放射自显影观察结果。
1.6　构建核酶重组逆转录病毒载体和转染病毒包装细胞　分别将核酶基因与逆转录病毒载体pDORneo(6.5kb)和N2A-tRNA(9.7kb)进行重组，后者需用一对新的引物PCR扩增核酶基因使在其两端引入新的酶切位点MluⅠ和SacⅡ及polⅢ启动子终止序列CGTTTTTGG，两种载体对插入基因的转录机制不同，分别由pol Ⅱ类启动子和pol Ⅲ类启动子控制。重组载体经PCR鉴定后转染包装细胞PA317，转染在Lipofectamine介导下进行，转染细胞经G418筛选。收集含病毒培养上清，以一定稀释梯度在聚糖胺(polybrene)介导下感染小鼠NIH/3T3细胞，测定重组病毒滴度。
1.7　细胞转导及HBV标志物检测　2.2.15细胞用含10%胎牛血清的MEM培养，培养液中加G418至380μg/ml。细胞转导时在加入重组病毒或对照病毒的同时加入polybrene至8μg/ml。转导后每周对细胞传代1次(第1次为3天)，传代前收集细胞培养上清液冻存备检。HBV标志物检测按厂商提供方法进行3次平行检测，抑制率(%)＝［(对照孔P/N值-实验孔P/N值/(对照孔P/N值)-2.1］×100%^［10］，抑制率＜30%为无意义，30%～50%为有轻度抑制作用，＞50%为有明显抑制作用^［11］。

2　结果
2.1　核酶基因的合成序列见图1。人工合成克隆后的核酶基因经DNA序列分析证实与实验设计完全一致，HBV靶基因片段的克隆经酶切鉴定和序列分析也证实准确无误。

图　1　核酶基因的合成序列
黑框为催化中心序列
Fig.1　Synthesized sequence of the ribozyme gene
Black form: Sequence of the catalytic core
2.2　核酶体外转录及对HBV靶基因转录物的切割　核酶对底物的切割示意图见图2，对HBV基因转录物的切割结果见图3。按照实验设计体外转录RNA长度核酶为159nt，底物为520nt，底物经核酶切割后可出现116nt/404nt、128nt/392nt和137nt/383nt三种带型组合，自制转录分子量参照分别为59nt和197nt。实验结果显示的转录和切割条带与预期结果相符，当核酶与底物分子比为1∶1时，扫描显示80%的底物分子被切割，增加分子比至5∶1时，底物可被完全切割，并伴随3′端底物切割带的降解。

图　2　核酶对底物切割示意图
Fig.2　Sketch map for the cleavage of HBV substrate by the ribozyme

2.3　重组逆转录病毒获取　核酶基因与pDORneo和N2A-tRNA连接后分别得到重组质粒pDOR-ripc和tRNA-ripc，用PCR鉴定均可扩增出相应的插入带。用Lipofectamine介导重组质粒转染PA317细胞效率较高，可形成10³转化集落/μgDNA，转化细胞传代稳定。用PA317细胞培养上清感染小鼠NIH/3T3细胞，经G418筛选后计数抗G418集落形成数，测定上清中重组病毒滴度分别达到1.6×10⁵ CFU/ml(pDOR-ribc)和1.2×10⁵ CFU/ml(tRNA-ribc)。
2.4　pHSA-R表达检测　逆转录病毒介导核酶基因转入2.2.15细胞后对pHSA-R表达产生了一定抑制，在转导后4周内抑制率最高为51.45±4.57%，最低为41.01±4.16%，结果见表1，不同启动子类型的重组病毒产生的抑制率无显著差别，对2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抗原未产生明显影响。

3　讨论
　　目前对清除感染者体内乙肝病毒尚缺乏有效手段，核酶技术结合转基因手段为治疗乙型肝炎的研究开辟了新的途径。实验结果表明，本文设计合成的针对HBV前S2基因位点的核酶在体外可有效切割靶基因，并且切割是在37℃和未对底物预先热变性条件下进行的，符合生理状态核酶对底物的切割环境。我们发现三靶位核酶对相应切割位点的切割效率有所不同，图3显示核酶分子与底物分子比为1∶1时，底物切割后以128nt/392nt带型为主，116nt/404nt带型较弱，137nt/383nt带型则未检出，分析原因可能有以下两点：一是产生128nt/392nt带型的切割位点为GUC，产生另两种带型的切割位点为CUC，GUC对锤头状核酶的

表　1　核酶在2.2.15细胞中对pHSA-R表达的抑制率

Tab.1　Inhibition of pHSA-R expresson in 2.2.15 cells

作用较CUC敏感^［12］；二是底物二级结构可能对核酶与底物的结合产生了影响。

图　3　核酶基因体外转录及对HBV靶RNA分子切割
1∶自制分子量参照；2∶核酶；3∶底物；4∶核酶加底物(分子比5∶1)；5∶核酶加底物(分子比1∶1)
Fig.3　Cleavage of the radiolabelled HBV substrate by the ribozyme
　　1∶RNA molecular marker 2∶Ribozyme.3∶Substrate.4∶Substrate after cleavage(molecular ratio of ribozyme to substrate is 5∶1).5∶Substrate after cleavage(molecular ratio of ribozyme to substrate is 1∶1)

　　在体内或细胞内，用于抑制病毒生长的核酶的表达需要满足两个条件：稳定表达和高效表达。本文用逆转录病毒为载体介导核酶基因转移，对2.2.15细胞内整合的HBV前S2基因表达产生了持续稳定的抑制，说明核酶基因在细胞内呈稳定表达状态。影响高效表达的因素较多，其中之一是启动子的选择，有文献报告pol Ⅲ类启动子更适于核酶的表达^［13］，但本文未观察到两种表达系统对核酶细胞内抑制相应基因的表达有显著差别。核酶的作用仅限于影响pHSA-R的表达，而对HBsAg、HBeAg的表达无显著抑制作用，分析原因可能是核酶对前S2基因产物的作用不完全，不足以对HBV复制和逆转录过程产生明显影响。此外，由于受细胞内环境因素制约，核酶往往达不到在细胞外实验中产生的对底物的切割效果^［4］。因此，核酶在细胞内的高效表达和定向表达是核酶应用于体内的必要前提，也是我们努力的方向。

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　　1997年10月13日收稿　1998年3月12日修回